可以起诉。针对您提出的问题，即老爸抚养奶奶二十多年，而大伯不抚养奶奶是否可以起诉，我们可以从以下几个角度进行分析：
一、法律义务角度
根据《中华人民共和国民法典》的相关规定，成年子女对父母负有赡养、扶助和保护的义务。这意味着，无论是您的老爸还是大伯，作为奶奶的子女，都有义务对奶奶进行抚养。如果大伯没有履行这一义务，那么从法律上讲，是可以对其进行起诉的。
二、起诉主体与程序
起诉主体：在一般情况下，赡养纠纷的起诉主体可以是赡养义务人（即您的老爸或奶奶本人，如果奶奶具备完全民事行为能力的话）或者赡养权利人（即奶奶）的近亲属。由于您提到老爸已经抚养奶奶二十多年，可以推测老爸可能是作为实际赡养人或者奶奶的代理人来提起诉讼。
起诉程序：要起诉大伯不履行赡养义务，首先需要收集相关证据，如奶奶的生活状况、大伯未履行赡养义务的证明等。然后，可以向法院提起民事诉讼，要求大伯履行赡养义务或者支付相应的赡养费。
三、可能的结果与影响
法院判决：如果法院认定大伯确实未履行赡养义务，那么法院可能会判决大伯履行赡养义务或者支付赡养费。这将对大伯产生法律约束力，迫使其履行赡养责任。
家庭关系：虽然法律可以强制大伯履行赡养义务，但这也可能对家庭关系产生一定的影响。因此，在提起诉讼之前，建议先尝试通过家庭协商或者调解的方式解决问题，以维护家庭和谐。
四、建议与注意事项
收集证据：在提起诉讼之前，务必收集好相关证据，以证明大伯未履行赡养义务。这些证据可以包括奶奶的生活状况、医疗记录、大伯的经济状况等。
咨询专业律师：虽然我可以为您提供法律咨询，但在实际操作中，每个案件的具体情况都有所不同。因此，建议您在提起诉讼之前咨询专业律师，以获取更具体的法律建议和指导。
考虑家庭和谐：在解决赡养纠纷时，除了考虑法律手段外，还应考虑家庭和谐的因素。尝试通过家庭协商或者调解的方式解决问题，可能更有利于维护家庭关系。