结论前置：在离婚诉讼中，分居期间的抚养费是可以一并主张的。
法律依据与法理分析
抚养义务的法定性：
- 根据《中华人民共和国民法典》第一千零五十八条，夫妻双方平等享有对未成年子女抚养、教育和保护的权利，共同承担对未成年子女抚养、教育和保护的义务。这一义务不因夫妻分居而消除。
- 第一千零六十七条进一步规定，父母不履行抚养义务的，未成年子女或者不能独立生活的成年子女，有要求父母给付抚养费的权利。
分居期间的抚养费主张：
- 分居期间，虽然夫妻双方处于分开生活的状态，但抚养子女的法定义务并未解除。若一方在分居期间未履行抚养义务，另一方在离婚时有权主张对方支付相应的抚养费。
- 从法理上分析，夫妻关系存续期间的分居并不改变双方对子女的法定抚养义务。即使夫妻处于分居状态，不直接抚养子女的一方仍然需要履行其抚养义务。
司法实践情况
- 在司法实践中，法院通常会支持直接抚养方在离婚时主张分居期间抚养费的诉求。法院在审理此类案件时，会综合考虑子女的实际需要、父母的经济能力、当地的生活水平等因素，来确定抚养费的具体数额和支付方式。
- 例如，如果当地生活水平较高，子女的教育和生活费用相应增加，且未直接抚养方具备较好的经济条件，法院可能会判决较高的抚养费数额；反之，则会根据实际情况进行适当调整。
实际操作与证据要求
- 主张主体：主张分居期间抚养费的主体通常是未成年子女，由直接抚养方作为法定代理人代为主张。
- 证据准备：
- 分居事实的证明，如租房合同、居住证明等，以证明双方处于分居状态。
- 子女实际生活开销的记录，如支出明细、发票、收据等，以证明抚养费用的实际发生。
- 对方未履行抚养义务的证据，如银行转账记录（显示对方未支付抚养费）、证人证言等。
注意事项
- 及时主张：在离婚诉讼中，应及时提出分居期间抚养费的主张，以免错过诉讼时效或影响法院的判决。
- 合理主张：抚养费的数额应根据子女的实际需要、父母的经济能力以及当地的生活水平等因素进行合理主张，避免过高或过低。
- 法律责任：如果在分居期间未支付抚养费，离婚时需要面对这个问题，并可能承担相应的法律责任，包括补付抚养费和可能的利息等。
示例说明
假设一对夫妻在分居期间，子女由母亲直接抚养，父亲未支付任何抚养费。在离婚诉讼中，母亲作为法定代理人可以代表子女主张父亲支付分居期间的抚养费。法院在审理时，会考虑子女的实际需要（如教育、医疗、生活等费用）、父亲的经济能力（如收入、财产等）以及当地的生活水平等因素，来确定抚养费的具体数额。如果父亲具备较好的经济条件，且子女的实际需要较高，法院可能会判决父亲支付较高的抚养费数额。
总结：分居期间的抚养费在离婚诉讼中是可以一并主张的。为了确保自身权益得到充分保护，建议直接抚养方在离婚诉讼中及时提出主张，并准备好相关证据以支持自己的诉求。如果你有任何具体的法律问题或需要进一步的法律帮助，请随时向我咨询。