结论：在特定条件下，可以起诉层层穿透股东的股东未实际出资，但需满足一定法律要件和程序要求。以下从不同角度进行详细分析：

一、法律背景与依据

1. 《公司法》及相关司法解释：

   • 根据《公司法》及其司法解释，股东有义务按照约定实际出资。若股东未履行或未全面履行出资义务，公司或其他股东有权要求其承担违约责任。
   • 在特定情况下，如股东滥用公司法人独立地位和股东有限责任，逃避债务，严重损害公司债权人利益的，债权人可以请求法院否认公司法人独立地位，要求股东对公司债务承担连带责任。这一原则在司法实践中可能延伸至对层层穿透股东的股东的追责，但需具体案件具体分析。

2. 合同相对性原则与突破：

   • 原则上，合同具有相对性，即合同关系只能发生在特定的合同当事人之间。然而，在股权转让等特定情境下，若存在欺诈、恶意串通等情形，可能突破合同相对性原则，允许非合同当事人（如后续股东或债权人）追究前手股东的责任。

二、起诉层层穿透股东的股东未实际出资的条件

1. 存在未实际出资的事实：

   • 必须有确凿证据证明层层穿透的股东（即目标股东的股东）未按照约定实际出资。这通常包括出资协议、公司章程、银行转账记录等证据。

2. 存在法律上的关联关系：

   • 起诉方需要证明目标股东的未出资行为与层层穿透的股东之间存在法律上的关联关系，如目标股东的未出资是由于层层穿透的股东的指示、控制或欺诈等行为导致的。

3. 满足起诉的主体资格：

   • 起诉方通常是公司、其他股东或公司债权人。公司或其他股东可以直接以股东身份起诉未出资的股东；公司债权人则需要在满足一定条件下（如公司无法清偿债务），通过否认公司法人独立地位等途径追究股东责任。

4. 遵循法律程序：

   • 起诉前应确保已履行了必要的法律程序，如向目标股东发出催告函、要求其履行出资义务等。若目标股东仍不履行，方可考虑起诉其股东（即层层穿透的股东）。

三、实际操作中的难点与建议

1. 证据收集与固定：

   • 起诉层层穿透股东的股东未实际出资，关键在于证据的收集与固定。建议起诉方在起诉前充分收集相关证据，包括出资协议、公司章程、银行转账记录、股东会决议、审计报告等。

2. 法律适用与解释：

   • 由于相关法律条文可能存在多种解释，建议在起诉前咨询专业律师，对法律适用进行准确判断。律师可以根据具体案件情况，结合相关司法解释和判例，为起诉方提供有针对性的法律建议。

3. 诉讼策略与风险评估：

   • 起诉层层穿透股东的股东未实际出资，可能涉及复杂的法律关系和较高的诉讼风险。建议起诉方在起诉前制定详细的诉讼策略，并对可能的风险进行充分评估。这包括考虑诉讼成本、诉讼周期、胜诉可能性等因素。

总结与建议：起诉层层穿透股东的股东未实际出资是一个复杂且具有挑战性的法律问题。在决定起诉前，建议起诉方充分收集证据、咨询专业律师、制定详细的诉讼策略，并对可能的风险进行充分评估。若您在此方面有任何疑问或需要进一步的法律帮助，请直接向我咨询。