关于上路行驶的农用机械车发生事故由谁负责的问题，这需要根据具体情况来确定责任归属。以下是对此问题的详细分析：

1. 若农用车满足上路行驶规定：

   • 农用车已经进行了登记，年检也合格，且驾驶员持有与之相应的驾驶证。
   • 在这种情况下，如果农用车正常行驶，而事故是由于对方的过错（如闯红灯、超速行驶等违反交通规则的行为）导致的，那么对方应当承担主要的责任，农用车的驾驶员可能只需承担次要责任。

2. 若农用车存在违法情形：

   • 农用车未登记、未年检，或者驾驶员没有驾驶证等。
   • 在这种情况下，由于农用车或其驾驶员存在违法行为，因此农用车的驾驶员往往需要承担主要的责任，甚至是全部的责任。

综上所述，上路行驶的农用机械车发生事故时的责任判定，主要取决于农用车及其驾驶员是否满足上路行驶的规定，以及事故发生的具体情形。责任的划分必须由交通管理部门通过对现场进行详细的勘查以及对相关证据的收集和分析来进行判定，以确保责任的认定公平、公正、合理。

如果你或你身边的人遇到了类似的问题，建议尽快联系交通管理部门，并配合他们进行事故调查和责任认定。同时，也可以向我咨询相关的法律问题，我会根据你的具体情况提供专业的法律建议。