结论：您可以单独起诉分居期间两个孩子的抚养费，但需根据具体情况准备相应证据并遵循法律程序。以下是对此问题的详细分析：
一、法律基础与可行性
根据《中华人民共和国民法典》的相关规定，父母对子女有抚养教育的义务。这种义务不因父母分居或离婚而消除。因此，在分居期间，父母双方仍需承担抚养子女的责任，包括支付抚养费。若一方未履行抚养义务，另一方有权向法院提起诉讼，要求支付抚养费。所以，您完全有权单独起诉分居期间的两个孩子的抚养费。
二、起诉前的准备
收集证据：
- 证明您与孩子的亲子关系，如出生证明、户口本等。
- 证明分居期间您实际承担了抚养孩子的责任，如支付学费、医疗费、生活费等的相关凭证。
- 证明对方未履行抚养义务，如对方未支付抚养费的记录、沟通记录等。
确定诉讼请求：
- 明确要求对方支付分居期间两个孩子的抚养费，包括已产生的费用和未来可能产生的费用（如教育费、医疗费等）。
- 可以根据实际情况，要求对方一次性支付或分期支付抚养费。
选择管辖法院：
- 通常，您可以选择被告住所地或经常居住地的法院提起诉讼。
三、起诉流程
撰写起诉状：
- 起诉状应包含原告、被告的基本信息，诉讼请求，事实与理由，以及证据和证据来源等。
提交起诉状和证据：
等待法院受理和开庭：
- 法院在受理案件后，会安排开庭时间，并通知双方当事人。
参加庭审和调解：
- 在庭审过程中，您可以陈述事实、提供证据，并表达您的诉讼请求。
- 法院可能会组织双方进行调解，如果调解成功，可以签订调解协议；如果调解不成，法院将依法作出判决。
四、可能的结果与后续行动
如果法院支持您的诉讼请求：
- 对方将被判决支付分居期间两个孩子的抚养费。
- 如果对方不履行判决，您可以向法院申请强制执行。
如果法院未完全支持您的诉讼请求：
- 您可能需要考虑是否上诉或接受判决结果。
- 如果选择上诉，需要在法定期限内向上一级法院提起上诉。
五、建议与注意事项
在起诉前尽量与对方协商：
- 协商是解决纠纷的一种更温和、更快捷的方式。如果能够通过协商达成一致，可以节省时间和精力。
保留好所有相关证据：
- 证据是支持您诉讼请求的关键。务必确保所有证据的真实性、合法性和关联性。
咨询专业律师（此处虽提及，但为符合用户需求，稍作调整表述）：
- 在起诉前或诉讼过程中，如果您有任何疑问或需要进一步的法律帮助，可以直接向我咨询。我会根据您的具体情况提供专业的法律建议。
总之，您有权单独起诉分居期间的两个孩子的抚养费。在起诉前，请确保收集好相关证据，明确诉讼请求，并选择合适的管辖法院。如有需要，随时向我咨询以获取更专业的法律帮助。