在多人乘坐一辆两轮电动自行车发生交通事故时，责任认定需结合具体情况，从多个角度综合分析。以下是核心结论及分情况说明：

1. 超载或违规载人影响责任认定
   根据《道路交通安全法实施条例》第七十一条，电动自行车在城市道路上行驶时，仅限搭载1名12周岁以下未成年人。若超载（如搭载多名成年人或超龄儿童），驾驶人可能因违反载人规定被认定存在过错，需承担主要或全部责任。例如：若因超载导致车辆失控引发事故，驾驶人通常需承担主要责任。

2. 驾驶人操作不当或违反交规的责任
   若驾驶人存在闯红灯、逆行、超速、酒驾、未佩戴头盔等违法行为，或未尽到安全驾驶义务（如未观察路况、突然变道），即使未超载，也可能被认定承担主要责任。例如：驾驶人逆行与正常行驶的机动车相撞，即使乘客未超载，驾驶人仍需承担全部责任。

3. 乘客的过错责任
   若乘客存在干扰驾驶（如拉扯方向盘、突然跳车）、未佩戴安全头盔等行为，且该行为与事故发生存在因果关系，乘客可能需承担部分责任。例如：乘客突然拉扯驾驶人手臂导致车辆失控，乘客可能需承担次要责任。

4. 第三方过错或不可抗力
   若事故由第三方（如其他车辆、行人）的违法行为导致，或因不可抗力（如突发恶劣天气、道路缺陷）引发，责任需根据各方过错程度划分。例如：正常行驶的电动自行车被闯红灯的机动车撞倒，机动车驾驶人需承担全部责任。

建议行动：

• 事故发生后立即报警，由交警部门通过现场勘查、监控录像、证人证言等证据综合认定责任；
  
• 保留医疗记录、车辆损坏照片等证据，以便后续维权；
  
• 若对责任认定有异议，可在收到《道路交通事故责任认定书》后3日内申请复核。
  

如有进一步疑问，可直接向我咨询具体场景下的责任划分问题。