两个孩子父亲不同，通过亲子鉴定是可以做出区分的。以下从法律和实际操作两个角度进行详细分析：

法律角度

1. 亲子鉴定的法律效力：

   • 亲子鉴定结果在法律上具有重要地位，是处理亲子关系争议的重要依据。根据《最高人民法院关于适用〈中华人民共和国民法典〉婚姻家庭编的解释（一）》的相关规定，如果一方（如父亲）向人民法院起诉请求否认亲子关系，并已提供必要证据予以证明，另一方没有相反证据又拒绝做亲子鉴定的，人民法院可以认定否认亲子关系一方的主张成立。这意味着，亲子鉴定结果可以作为法律判决的依据。

2. 亲子关系的法律认定：

   • 如果两个孩子的父亲不同，通过亲子鉴定可以明确每个孩子的生物学父亲。法律上，亲子关系的认定对于抚养权、抚养费、继承权等法律问题的处理至关重要。

实际操作角度

1. 亲子鉴定的实施：

   • 亲子鉴定应由具有资质的鉴定机构进行，以确保鉴定结果的准确性和法律效力。这些机构通常使用先进的DNA检测技术，能够准确判断亲子关系。
   • 在实际操作中，如果两个孩子的父亲不同，可以分别对每个孩子与其可能的父亲进行亲子鉴定。通过比较DNA样本，鉴定机构可以明确每个孩子的生物学父亲。

2. 鉴定结果的解读：

   • 鉴定结果通常会明确说明每个孩子与其可能的父亲之间是否存在生物学上的亲子关系。如果结果显示两个孩子的父亲不同，那么这一结论在法律上和实际操作中都是被认可的。

注意事项

• 选择正规鉴定机构：为了确保鉴定结果的准确性和法律效力，务必选择具有资质的正规鉴定机构进行亲子鉴定。
• 保护个人隐私：在进行亲子鉴定时，应注意保护个人隐私，避免信息泄露给无关人员。
• 法律后果：亲子鉴定结果可能对家庭关系、抚养权、抚养费等法律问题产生重大影响。因此，在做出鉴定决定前，应充分考虑可能的法律后果，并咨询专业律师的意见。

建议：如果您面临两个孩子父亲不同的情况，并希望通过亲子鉴定来明确亲子关系，请务必选择正规的鉴定机构进行鉴定，并在必要时咨询专业律师以了解可能的法律后果和应对策略。如果您有任何法律问题或需要进一步的法律帮助，请直接向我咨询。