针对您提出的问题，即非婚生孩子户口随父亲落户后，上小学时母亲户口不在一起是否需要做亲子鉴定，以下是我的详细解答：

首先，我们需要明确的是，非婚生育子女在随父亲申报出生登记时，根据公安部《户口居民身份证管理工作规范(试行)》的相关规定，是需要一并提供具有资质的鉴定机构出具的亲子鉴定证明的。这是为了确认孩子与父亲之间的生物学关系，确保户口登记的准确性和合法性。

然而，当孩子已经随父亲完成了户口落户，并且后续面临上小学等教育问题时，是否需要再次进行亲子鉴定，则主要取决于当地教育部门和学校的具体要求。一般来说，户口已经落户并确认了亲子关系的情况下，教育部门和学校不会再次要求提供亲子鉴定证明。他们更关注的是孩子的户口是否已经合法落户，以及是否符合入学条件。

但为了确保万无一失，我建议您在孩子准备上小学前，先咨询当地的教育部门或学校，了解他们对于非婚生育子女入学时户口和亲子关系证明的具体要求。如果教育部门或学校没有明确要求提供亲子鉴定证明，那么您就不需要再次进行亲子鉴定。

另外，如果母亲希望将孩子的户口迁移到自己的名下，或者孩子未来需要办理其他与户口相关的事宜，那么可能需要根据具体情况再次提供亲子鉴定证明或其他相关材料。

总的来说，非婚生孩子户口随父亲落户后，上小学时母亲户口不在一起，一般情况下不需要再次做亲子鉴定。但为了确保孩子能够顺利入学，我建议您提前咨询当地教育部门和学校的具体要求，并做好相应的准备。希望这个解答能够对您有所帮助。