核心结论：对于做生意款项百万元被职务犯罪分子非法侵占二十多年的差额计算问题，需结合侵占行为发生时、追诉时及判决时的法律规定、利率标准、是否涉及复利等因素综合判定，具体分以下情况说明：

1. 差额计算的法律基础：侵占本金与利息的认定

根据《中华人民共和国刑法》第二百七十一条（职务侵占罪）及相关司法解释，职务犯罪分子非法侵占公司、企业财产的，需退赔被害单位的经济损失。这里的“经济损失”通常包括：

• 本金：即被侵占的原始款项（如100万元）；
• 利息：若侵占行为导致被害单位产生资金占用损失，可主张利息赔偿。利息计算需明确：
  • 起算时间：一般从侵占行为发生时起算（如二十年前）；
  • 利率标准：可参照中国人民银行同期贷款利率（若侵占行为发生在1997年《刑法》修订前，需结合当时金融政策）；若侵占行为持续或后续产生复利，需根据具体证据和法律适用判断是否支持。

关键点：利息主张需以“实际损失”为前提，若被害单位能证明因侵占导致资金无法周转、产生额外融资成本等，法院可能支持合理利息；若无法证明，可能仅支持本金退赔。

2. 追诉时效与法律适用的影响

• 追诉时效：职务侵占罪的追诉时效为15年（若最高刑为五年以上不满十年有期徒刑），但若侵占行为持续（如通过虚假账目掩盖侵占事实），时效可能从行为终了之日起计算。若二十年后仍可追诉，不影响差额计算，但需提供持续侵占的证据。
• 法律修订：1997年《刑法》修订后，职务侵占罪的定罪量刑标准发生变化。若侵占行为跨越修订前后，需根据“从旧兼从轻”原则适用法律，但差额计算仍以实际损失为准。

3. 实务操作建议

1. 收集证据：
   • 证明侵占事实的书面材料（如合同、账目、审计报告）；
   • 证明资金占用损失的证据（如银行流水、融资合同、利息支付凭证）；
   • 侵占行为持续的证据（如年度审计报告、证人证言）。
2. 计算差额：
   • 委托专业机构（如会计师事务所）出具《资金占用损失专项审计报告》，明确本金及利息金额；
   • 若涉及复利或高额利息，需符合法律规定（如不超过LPR四倍），否则可能被法院调整。
3. 诉讼策略：
   • 若侵占人已无偿还能力，可同时起诉其关联方（如配偶、实际控制企业）承担连带责任；
   • 申请财产保全，防止侵占人转移资产。

4. 风险提示

• 若侵占行为发生在二十年前，可能面临证据灭失风险（如账目丢失、证人去世），需尽快固定证据；
• 若侵占人已死亡或破产，退赔可能难以执行，需提前调查其财产状况。

总结：差额计算需以实际损失为基础，结合证据、法律修订及实务操作综合判定。建议尽快委托律师介入，通过刑事报案+民事诉讼双途径追偿，最大限度维护权益。如有进一步证据或细节，可随时向我咨询，我会结合具体案情提供更精准的建议。